2. 1. 6. Preparación de los medios de cultivo.

La preparación de medios de cultivo incluye la manipulación de múltiples sustancias. Esta preparación puede simplificarse mediante el uso de:

•      Packs listos para usar, disponibles para medios frecuentemente utilizados. Habitualmente constan de medio base, sin reguladores.

•      Elaboración de soluciones stock mas concentradas, agrupando los compuestos en varias soluciones stock, por ejemplo:

Stock 1: Macros (x10)

Stock 2: Sales de Calcio (x 10)

Stock 3: Micronutrientes (x 100)

Stock 4: Solución de hierro

Stock 5: Vitaminas (x 100)

Stock 6: Reguladores (cada uno individualmente) (x 200)

Estas soluciones stock se conservan en nevera (stock 1, 2, 3 y 4) o congelador (stock 5 y 6), según los compuestos que contengan, durante meses. Algunas soluciones deben conservarse en oscuridad.

Equipo automático de preparación y dosificación de medio de cultivo.

Algunos aspectos relevantes al preparar el medio o las soluciones stock:

La cantidad de un compuesto a añadir, en peso, es función de su grado de hidratación. Lo relevante es mantener la molaridad del nutriente; a igual peso del compuesto, cuanto mayor grado de hidratación menor molaridad del nutriente.

La concentración de una solución stock está limitada por la solubilidad de sus compuestos y por las interrelaciones entre ellos. La disolución de los compuestos no debe dar lugar a reacciones entre ellos que causen algún tipo de precipitación o que disminuyan su capacidad de incorporación al explanto.

Algunos compuestos, por ejemplo muchos reguladores de crecimiento, son poco hidrosolubles. Para preparar sus soluciones stock se disuelven en una pequeña cantidad de soluciones ácidas o básicas (OHNa 1N, HCl 1N), solventes orgánicos (ej. DMSO), o etanol, teniendo siempre presente el potencial efecto (toxicidad, efecto sobre el pH, etc.) de dichos solventes.

Los compuestos termolábiles deben ser incorporados mediante filtración al medio ya autoclavado y a temperaturas cercas a la temperatura ambiente pare evitar su degradación.

Compuestos	Degradación por el calor	Referencias
ABA	Ligera	Catálogo Sigma
Sulfato de adenina		Liau y Boll,1970
Ácido L-ascórbico		Catálogo Sigma
L-asparagina		Liau y Boll, 1970
Pantotenato cálcico	Alta	Dodds y Roberts, 1982; Catálogo Sigma
Ácido trans-cinámico		Catálogo Sigma
Cisteina		Butenko, 1964
Benziladeninaribósido		Catálogo Sigma
Cloruro de colina		Liau y Boll, 1970
Ácido fólico		Liau y Boll, 1970
Fructosa	Substancias inhibidoras	Stehsel y Caplin, 1969
Ácido geberélico	Ligera	Butenko, 1964; Watson y Haperin, 1981
L- glutamina	Alta	Liau y Boll, 1970; Thompson et al. 1977
IAA	Degradación de un 40% en 20 minutos de autoclavado	Nissen y Sutter, 1988; Catálogo Sigma
IAA-L-alanina	Ligera	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IAA- L-ácido aspártico	Pronunciada	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IAA-glicina	Ligera	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IAA-L-fenilalanina	Ligera	Pence y Caruso, 1984; Catálogo Sigma
IBA	Degradación de un 20% en 20 minutos de autoclavado	Nissen y Sutter, 1988; Catálogo Sigma
Kinetina	Ligera	Catálogo Sigma
Extracto de malta	Substancias inhibidoras	Solomon, 1950
Nicotinamida		Liau y Boll, 1970
Ácido nicotínico		Liau y Boll, 1970
N,N'-dimetilurea	Total	Schmitz y Skoog, 1970
Ácido pantoténico	Alta	Dodds y Roberts, 1982; Catálogo Sigma
PBA	Ligera	Catálogo Sigma
Phloridzina		Krikorian et al. 1982
Piridoxina	Ligera	Singh y Krikorian, 1981
Riboflavina		Liau y Boll, 1970; Catálogo Sigma
2-iP	Ligera	Catálogo Sigma
2-iP ribósido		Catálogo Sigma
Tiamina	Alta a pH >5.5	Linsmaier y Skoog, 1965; Liau y Boll, 1970
L-triptófano		Butenko, 1964; Catálogo Sigma
Urea		Liau y Boll, 1970; Peters y Mayne, 1974
Zeatina	Ligera	Catálogo Sigma

2. 2. Esterilización

La esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie se libera completamente de cualquier microrganismo vivo o espora. Se dice que tales materiales y sitios so estériles o se han esterilizado. En la terminología médica se utiliza generalmente la palabra asepsia para designar la condición en la que están ausentes los microrganismos patógenos; quienes trabajan en el cultivo de tejidos de plantas utilizan la palabra aséptico como sinónimo de estéril.

La desinfección se limita generalmente al proceso de destrucción de los microrganismos mediante métodos químicos; la esterilización se refiere a menudo al método físico para la destrucción de los microrganismos. Se utiliza la palabra axénico para las preparaciones que están libres de virus, viroides o microplasmas.

Bibliografía

• http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm
• Roca & Mroginski. (1982). Experimentes in Plant Tissue Culture. Cambridge University Press.

TAREA 1

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO

MEDIOS QUÍMICAMENTE DEFINIDOS

Un medio químicamente definido es aquel donde su composición química exacta es conocida. Algunos ejemplos de medios químicamente definidos para el cultivo de plantas in vitro son;

Medio de cultivo de White (1934)

Este medio fue utilizado por White en 1939, en el logro que el tejido de los ápices de raíz de jitomate (Lycopersicon esculentum) se desarrollaran exitosamente en un medio liquido el cual contenía sales inorgánicas, extracto de levadura y sacarosa.

Medio B5 (Gamborg, 1970-1976)

Gamborg trabajó activamente en la elaboración de medios de cultivo para tejidos vegetales, a los que dio diferentes números para nombrarlos . EL B5 fue formulado para cultivo de callo de soja.

Macro
(NH4)2SO4	0.134 g/l
KNO3	2.528 g/l
MgSO4.7H2O	0.246 g/l
CaCl2.aq	0.15 g/l
KH2PO4	0.15 g/l
Micro
KI	0.75 mg/l
H3BO3	3.0 mg/l
MnSO4.H2O	10 mg/l
ZnSO4.7H20	2.0 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l
FeSO4.7H2O	27.8 mg/l

Medio Hildebrandt, Riker y Duggar (1946)

Medio utilizado para el cultivo de tejidos vegetales in vitro.

Hilderbrandt, C. C.,A.J.Riker y B. M. Duggar. 1946. The influence of the composition of the medium of growth in vitro of excised tobacco and sunflower tissue cultures. Am. J. Bpt. 33:591-597.

Otros medios de cultivo químicamente definidos:

• Heller y Miller (1958)
• Knop (1865)
• Linsmaier y Skoog (1965)
• Nitsch y Nistch (1956)
• Sachs (1890)
• Torrey y Shigemura (1957)
• Chu (1978)
• Gautheret (1942)

SUSTANCIAS NATURALES PARA EL CULTIVO IN VITRO

Muchas preparaciones de composición indefinida han sido empleadas para enriquecer los medios de cultivo; frecuentemente se han empleado con como última alternativa después de que todos los ingredientes definidos del medio han fallado en el establecimiento de cultivos de células y órganos vegetales. Ejemplos de estas preparaciones son las siguientes:

Ingredientes	Concentración
Pulpa de plátano	150 g/l
Endospermo de coco	10 a 20%
Extracto de malta	1 cu/I
Jugo de naranja	500 mg/l
Hidrolizado proteico (caseína, lactoalbúmina, peptona y triptona)	30 a 3000 mg/l
Jugo de tomate	30%
Extracto de levadura	50 a 5000 mg/l
Endospermo liquido de Zea mays	Variable
Endospermo liquido de Juglans	Variable
Jugo de pepino	Variable

Estas sustancias son por lo general termoestables. El hidrolizado proteico se emplea principalmente como fuete de aminoácidos. El jugo de naranja contribuye con el ácido cítrico, así como con otros estimulantes del crecimiento vegetal, no identificados. La pulpa de plátano y la emulsión de pescado se usan principalmente en los medios para cultivo de orquídeas, mientras que el extracto de malta y el extracto de levadura tienen un uso más general.

El trabajo con le endospermo de coco ha producido resultados sorprendentes. Si se utiliza junto con auxinas produce una fuerte división celular en los  tejidos (Steward, 1958). Kovoor (1962) vio que la leche de coco teniaunn compuesto análogo ala kinetina. Letham propuso la hipótesis de que los frutos de coco maduros contenían 9-β-D-ribofuranosilzeatina. Van Staden y drewis (1965) demostraron que contenia tanto zeatina como ribosido.

Estas mezclas deben ser evitadas en el trabajo de investigación ya que su composición es casi completamente desconocida. Por ejemplo el endospermo de coco no solo es diferente de los cocos jóvenes y viejos, sino que también puede serlo para cocos diferentes dentro de una misma edad.

BIBLIOGRAFÍA

• Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores. Editorial; mundi-prensa. Madrid, España 1989, p 326.
• Gonzales Rosas, Hector; Cruz Ramos, Alejandro. Biotecnología vegetal. CuliacanMexico 2000, p 133.
• Hurtado M, Daniel V. Cultivo de tejidos vegetales. Editorial; Trllas. 1988 México DF, p 23.