2. 1. 3. Generalidades de los medios de cultivo.

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denominará explanto, como por ej. el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas.

La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales.

El éxito en la propagación de una planta dependerá de la posibilidad de expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias, o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada es la composición del medio de cultivo.

No existen dudas que en todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie, y que está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.

2. 1. 4. Componentes del medio de cultivo.

Componentes de un medio de cultivo:

Compuestos inorgánicos

Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42-

Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-

Carbohidratos

Sacarosa, glucosa, mio-inositol

Vitaminas

Tiamina (B1)

Piridoxina

Acido nicotínico (C)

Biotina

Reguladores del crecimiento

Auxinas

Citocininas

Giberelinas

Soporte inerte (medios semisólidos)

Agar (0,7 a 1%)

Gelrite®

pH

5,6 – 5,8

Esterilización

1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Agua destillada

NUTRIMENTOS INORGANICOS

Los minerales son muy importantes en la vida de la planta; para un crecimiento sano y vigoroso se requiere de la presencia de compuestos inorgánicos que se agrupan en macro y micronutrientes.

Se requieren en cantidades de milimoles y son los elementos requeridos en mayor cantidad, (carbono C), oxígeno (O) e hidrógeno (N), aminoácidos, Vitaminas, proteínas y ácidos nucleicos. Comúnmente se adicionan como nitrato o amonio y menos usual como nitrito. El nitrito se añade en concentraciones de 25-40 milimoles y el amonio de 2 a 20 milimoles (Gamborg y Jerry, 1981) fósforo (P) empleado casi universalmente en forma de fosfatos; sin embargo, la alta concentración de fosfato en solución puede detener el crecimiento, azufre (S) como sulfato y con la posibilidad que se agregue en forma de sulfito o como sulfuro, pero con menos efectividad (Nitsch y Nitsch, 1969). Como fuente de azufre, además de los sulfatos, sulfitos, se encuentran la cisteína, metionina o glutation.

El fósforo, calcio, magnesio y azufre son requeridos en concentraciones de 1 a 3 milimoles para un buen crecimiento.

Micronutrientes

Se añaden en concentración micromolar. Los elementos menores son seis:

1.    Fierro (Fe)

2.    Zinc (Zn)

3.    Manganeso (Mn)

4.    Cobre (Cu)

5.    Cobalto (Co)

6.    Boro (B)

De los 6 elementos, el Zn, Mn, Fe, Cu y Mo intervienen en la síntesis de la clorofila y en la estructura del cloroplasto (Sundqvist et al, 1980). El manganeso es considerado como uno de los más esenciales, junto con el boro y el fierro; además tiene importancia de la fotosíntesis en donde interviene en la conservación de la ultraestructura de los cloroplastos. De acuerdo a Galston y Hillman (1961), el Mn es un cofactor de las enzimas peroxidasa que permiten la oxidación del ácido indolacético en las células vegetales.

           

El zinc, particularmente, participa en el desarrollo normal del sistema radical del jitomate (Eltinge y Reed, 1940). Cobre forma parte de enzimas oxidasas que están involucradas en la oxidación e hidroxidación de compuestos fenólicos, ácido abscísico y dopamina (Lerch, 1981).

El boro tiene su efecto más importante en inducir el crecimiento del tejido diferenciado e indiferenciado. En dicotiledones, la deficiencia de boro frecuentemente permite un aumento en el crecimiento de cambium; asimismo, la deficiencia propicia una depresión de las citocininas lo que trae como consecuencia un incremento en la concentración endógena de las AUXINAS.

El cobalto se encuentra en la estructura de análogos de la vitamina B₁₂ que es involucrada en la síntesis de los ácidos nucleicos (Fries, 1962). El fierro es requerido para la formación de ácido aminolevulínico y protoporfirinógeno que son precursores temprano y tardío de la clorofila, respectivamente.

El fierro se usa como FeSO₄ o FeCl₂, pero en valores superiores de pH 5.2 se precipita como Fe(OH)₂, tal como ocurre en el cultivo de raíz de jitomate, ocasionando deficiencia de fierro.

El tartrato férrico a pH 6.0 y el EDTA-Fe a pH 7.2 son en la forma en que se les usa. En medios líquidos, el citrato férrico o el tartrato férrico es utilizado en lugar del FeCl₃. Recientemente investigadores utilizan el Fe en forma de citrato, tartrato o de EDTA-Fe.

Complementos orgánicos

Se consideran complementos microorgánicos a los compuestos orgánicos que se han llamado así porque el crecimiento y en general la morfogénesis se ven mejorado.

Se agrupan en:

·         Vitaminas

·         Aminoácidos

·         Complejos naturales de composición química indefinida

·         Reguladores del crecimiento

Vitaminas

Estas sustancias, que normalmente sintetizan las plantas, son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.

Tiamina (B1)

Es fotoestable, pero durante la esterilización por autoclave se descompone en pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayoría de los tejidos son capaces de sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposición. En la naturaleza, especialmente los cereales aparecen libre y en concentraciones relativamente elevada.

Piridoxina (B6)

Se localiza en semillas de cereales y no se considera esencial para la mayoría de las plantas in vitro. Quizá el papel más importante en su participación, bien conocida, en la síntesis de purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los ácidos nucleicos.

Ácido nicotinico

Es foto y termoestable. Su principal función es ser coenzima  de las enzimas que se conoce como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reducción (NAD, NADP Y NADH o NADPH).

Riboflavina

Es termoestable, pero fácilmente se descompone a la luz. A bajas concentraciones (90.01 mg.l^-l) promueve el crecimiento en callos habituados de zanahoria, pero sin efecto en la oscuridad. Concentraciones de 10-50mg.l^-1  inhiben completamente el crecimiento en la luz y promueve el crecimiento en la oscuridad (Butenko, 1968).

Ácido pantotécnico

Es termoestable, por lo tanto, puede ser esterilizado en autoclave junto con el medio nutricional Estimula el crecimiento de levaduras, en sauce llorón y Juniperas (Morel, 1946; Gautheret, 1958). Sin embargo, no es una vitamina esencial.

Biotina

No es esencial y probablemente promueve el crecimiento del cambio en inóculo de sauce llorón (Gautheret, 1959). La biotina sirve como factor de crecimiento de las levaduras y algunas bacterias.

Ácido fólico

No es esencial y se descompone con el calor en soluciones ácidas. En la oscuridad inhibe el crecimiento de los tejidos, mientras que en la luz lo promueve.

Aminoácidos

Los aminoácidos representan, para las células, una fuente efectiva e inmediata de nitrógeno, puesto que se pueden incorporar al metabolismo mucho más rápido que el nitrógeno inorgánico, aun cuando ambas fuentes se encuentran en el mismo medio (Thom et al., 1981), sin embargo, su incorporación al medio de cultivo es bastante discutida. Es conocido que su empleo esta en función del balance adecuado de la relación NH4/NO3 que es usualmente suministrado como NO3-, NH4, NO3, NH4Cl, etc.

Los aminoácidos son usados como constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas. Además, las formas racémicas son mejores para el desarrollo de tejidos que las formas puras -L de aminoácidos. Se han señalado efectos diferentes al usar isómeros de aminoácidos, por ejemplo: -L alanina es más fácilmente asimilado que la B-alanina. El ácido α aminobutírico no puede ser utilizado como fuente  de nitrógeno, pero puede remplazar completamente a los nitratos.

Es difícil definir si el papel de los aminoácidos es esencia o no; sin embargo, la adición de la caseína hidrolizada puede prevenir o inclusive asegurar la fuente de nitrógeno, ante la posible deficiencia de la fuente de amonio o nitrogeno inorgánico.

Carbohidratos

La sacarosa y la glucosa se utilizan en el cultivo de tejidos de muchas especies. La fructuosa, maltosa, celabiosa, rafinosa y otras, se les usa como fuente de carbono para algunas variedades de tejidos. Para la mayoría de los tejidos en cultivo es sacarosa la mejor fuente de carbohidratos (2-5%), de manera que el máximo aumento en peso fresco en los tejidos cultivados del endospermo del sorgo se obtiene con 2% de sacarosa, y el máximo de peso seco a 8

La combinación de algunos carbohidratos no son útiles para el crecimiento de tejidos vegetales como fuente única de carbono. Los ácidos orgánicos más efectivos, como el ácido succínico, ácido cítrico y ácido fumárico, desarrollan sólo de un 25 a 50% del crecimiento comparado con un tejido cultivado en el cual la fuente de carbono es la sacarosa.

Reguladores del crecimiento

Los reguladores de crecimiento se dividen en auxinas, citocininas, giberelinas y retardantes e inhibidores del crecimiento y son naturales y sintéticas.

Auxinas naturales

El ácido indolacético (AIA) es la única auxina natural que se localiza en las zonas de crecimiento. Tiene la peculiaridad de ser descompuesto por la luz, por lo que no es conveniente utilizarlo en cultivo en suspensión.

Auxinas sintéticas

Son auxinas sintéticas del ácido naftalenacético (ANA), ácido 2,4 diclorofenoxiacético y ácido indolbutírico (AIB).

Los tejidos aislados de plantas y las callosidades en subcultivos, requieren de auxinas. Los que no las requieren son los callos habituados y los tejidos tumorales. El AIA o el ANA son mejores que el 2,4-D para la inducción de la organizacióncelular.

Citocininas

Citocininas naturales son:

Zetina que se extrae del endospermo del maíz y 6 issopentanil adenina (2iP) que se aisla de Clostridium Tumerfaciens que produce un sobre crecimiento de los tejidos, éstas no son esenciales.

Citocininas sintéticas son:

6-benciladenina (6 BA) o también conocida como bencilanimopurina (6 BAP); la cinetina (K) también conocida como 6-furfiril aminopurina (FAP).

Ácido giberélico

El ácido giberélico no se usa conúnmente para el cultivo de callo. En ocasiones se adiciona al medio para inducir alargamiento del tallo, pero no es común su uso.

Ácidos nucleicos y compuestos con base de ácidos nucleicos

El ADN, ADN hirolizado no tiene efecto en tejidos bajo cultivo, pero el ARN estimula el crecimiento de callos de tabaco, maravilla y Rumex el efecto del ARN puede ser demostrado en presencia de citocinas.

El uracilo, citosina, guanina, xantina y timina no son efectivos para los callos de zanahoria. La mezcla de una citocinina y ácido orótico induce el desarrollo de la inflorecencia de Plumbago índica.

Substancias naturales

Las substancias naturales de las plantas ampliamente usadas son: de agua de coco (10-20%), extractos de levadura (EL) y se emplea en concentraciones de 0.01-0.05%, caseína hidrolizada (CH) se emplea desde 0.01% a 1.0% y extracto de malta (EM) que se adiciona desde 0.1 –0.5% también se usa peptona, jugo de tomate, pepino, del endospermo inmaduro de maíz y ácido casaamino.

Agar

El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus características físicas se emplea para solidificar el medio básico, cuando ses trabaja con cultivo estsacionario sólido o semi-sólido. Un buen agar es aquel que:

a. Hierve a 100 °C y que solidifica a 45 °C, aproximadamente. Esta característica le confiere estabilidad a cualquier temperatura de incubación.

b. No es digerido por enzimas vegetales.

c. No reacciona con los constituyentes del medio de cultivo

Hay  diferentes  grados  o  tipos  de  agares  y  generalmente  se  le considera como buen soporte del inóculo; sin embargo, datos proporcionados por compañías elaboradoras de agar comercial consignan que contiene pequeñas cantidades de tiamina, biotina y minerales, por lo que no es conveniente utilizarlo indiscriminadamente.

Existen otras opciones de agentes solidificantes, pero algunos por sus características físicas, no endurecen o hierven a las temperaturas que se requieren para su empleo en el cultivo de tejidos, por ejemplo: La gelatina tiene su punto de ebullición a 25°C, aproximadamente. Para el caso del cultivo de protoplastos, algunos autores han empleado alginatos que aunque tiene las ventajas de formar gel cuando se adiciona o se licua por la presencia de algún agente quelante o citrato de sodio. Presenta desventajas, como ser altamente termoinestable con los cationes bivalentes, ocasionado una eliminación de nutrientes (Button y Botha, 1975).

2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock.

Una solución es una mezcla homogénea cuyas partículas son menores a 10 ángstrom. Estas soluciones están conformadas por soluto y por solvente. El soluto es el que está en menor proporción y por el contrario el solvente esta en mayor proporción. Tosas las soluciones son ejemplos de mezclas homogéneas.

  Solución diluida es cuando la cantidad de soluto es muy pequeña.

  Solución concentrada es cuando la cantidad de soluto es muy grande.

  Solución saturada es cuando se aumento mas soluto en un solvente a mayor temperatura de la normal (esto es porque cuando ya no se puede diluir, se calienta el solvente y se separan sus partículas para aceptar mas soluto)

  Solución sobresaturada es cuando tiene más soluto que disolvente

Soluto y Disolvente

Las sustancias que están presente en la mayor cantidad se denomina disolvente, que se define como la sustancia en la cual se disuelve otra. Ésta última, que es la que disuelve en la primera, se denomina

                                                             Soluto + Disolvente = Solución



Dilución de soluciones y solución stock

Para diluir una solución es preciso agregar más % de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian, aunque el soluto no.

Una solución stock es la cual a partir de ella se puede hacer una disolución:

Sales minerals MS (Murashige and Skoog, 1962)

                                                (g/l)

(NH₄)NO₃                             1,650

KNO₃                                    1,900

 CaCl₂.2H₂O                        0,440

MgSO₄.7H₂O                       0,370

KH₂PO₄                                0,170                        MS X 10

FeSO₄.7H₂O                         0,0278

Na₂EDTA. 2H₂O                  0,0372                     MS X 200

MnSO₄.H₂O                          0,0169

ZnSO₄.7H₂O                         0,0086

H₃BO₃                                    0,0062

KI                                            0,00083

Na₂MoO₄.2H₂O                    0,00025

CuSO₄.5H₂O                         0,000025

CoCl₂.6H₂O                           0,000025           MS X 100

Mioinositol                            0,100

Tiamina HCl                          0,0001

Acido nicotínico                  0,0005

PiridoxinaHCl                       0,0005

Glicina                                     0,002                  MS X 200

SACAROSA                                    30 g.

AGAR-AGA                                    7 g.

Para la preparación de soluciones stock  de macro y micro nutrientes en un medio  MS x100 se utiliza la siguiente formula:

MS x concentración x volumen     

                1000

Cuando las concentraciones de los macro y micronutrientes se dan en mg/l solo basta con cambiar la constante a 1000000 para lograr la conversión a g/l.

Esta fórmula es la ideal para realizar las soluciones, de igual manera se puede utilizar una regla de tres para la resolución de las concentraciones.

En el caso de los reguladores de crecimiento la solución será un poso diferentes ya que las cantidades utilizadas son muy pequeñas y se expresan en parte  por millón (ppm).

1 ppm= 1 mg/l

Teniendo esta equivalencia podemos calcular la cantidad a disolver en el volumen que deseamos.

Por ejemplo para preparar 20 ml de B.A.P a 1000 ppm (mg/l) se realiza la siguiente regla de tres:

1000 mg B.A.P ------------- 1 l

                     X -------------- 0,02 l   

= 20 mg B.A.P

Pero como se requiere de las cantidades en gramos, lo único que tenemos que hacer es dividir esta cantidad por 1000 entonces tendríamos la cantidad de: 0,0200g de B.A.P

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo.

Estas soluciones deben guardarse a 4 ºC.

Bibliografía

• W.M. Roca, L.A. Mroginski. Cultivo de tejidos en la agricultura (fundamentos y aplicaciones). Publicación CIAT.
• http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf